INFETTIVOLOGIA MOLECOLARE

Chlamydia trachomatis

Aspetti generali

Il batterio Chlamydia trachomatis (CT) è l’agente eziologico di numerose malattie a trasmissione sessuale. CT è un microrganismo molto piccolo, che si moltiplica esclusivamente nel citoplasma della cellula ospite; la CT è un parassita endocellulare obbligato, totalmente incapace di produrre ATP e altri cofattori necessari per le attività vitali. L’infezione da CT, generalmente asintomatica (70% dei casi) può manifestarsi nelle donne con leucorrea, bruciore vulvo-vaginale e ad urinare; può provocare nelle donne uretriti, cerviciti, infiammazioni pelviche che possono condurre a sterilità; nei maschi epididimite.

In gravidanza l’infezione da CT può essere causa di corioamnionite, gravidanze ectopiche, rottura prematura delle membrane, parto pretermine, endometrite postpartum. La CT può essere tramessa durante il parto anche al neonato causando congiuntivite e/o polmonite.

Test molecolare

Dal momento che le infezioni da CT sono frequenti e asintomatiche e quelle clinicamente manifeste possono non essere facilmente distinte da altre infezioni e trasmissione sessuale, negli ultimi anni con lo sviluppo di tecniche di biologia molecolare, come la Real Time PCR, sono stati introdotti test che permettono una identificazione rapida e precisa del patogeno. La metodica utilizzata è basata sulla tecnica PCR Reverse Dot Blot che garantisce massima affidabilità e tempi di risposta rapidissimi.

Materiale analizzato

DNA estratto da tamponi cervico-vaginali, uretrali, rettali, urina, liquido seminale.

Tempi di risposta

Il risultato del test molecolare per la ricerca di CT è disponibile dopo poche ore dall’arrivo del campione in laboratorio.

Neisseria gonorrhoeae

Aspetti generali

Il batterio Neisseria gonorrhoeae (NG) è un batterio intracellulare facoltativo, tipicamente aggragato a coppia (diplococco) che causa una malattia a trasmissione sessuale chiamata gonorrea. NG è un patogeno particolarmente fragile, suscettibile a variazioni di temperatura, per cui la sopravvivenza al di fuori dell’organismo umano, unico ospite, è limitata. Nei maschi NG infetta preferenzialmente la mucosa del tratto uretrale, provocando secrezioni purulente e bruciore, mentre nella donna colonizza la mucosa cervicale e il collo dell’utero e può minifestarsi con leucorrea abbondante mucopurulenta e bruciore vulvo-vaginale e ad urinare.
L’infezione può essere silente e riconosciuta solo all’insorgere di complicanze. Nelle donne in gravidanza l’agente infettivo può essere trasmesso al feto per via ascendente a partire dalla cervice infetta o più frequentemente intrapartum durante il passaggio del feto nel canale del parto. L’infezione per via ascendente può determinare, se non trattata, aborto, corioamnionite, rottura prematura delle membrane, parto pre-termine, endometrite postpartum. L’infezione intrapartum può essere causa di congiuntivite neonatale, che, se non trattata, può portare alla cecità.

Test molecolare

Dal momento che le infezioni da NG sono frequenti e asintomatiche e quelle clinicamente manifeste possono non essere facilmente distinte da altre infezioni e trasmissione sessuale, negli ultimi anni con lo sviluppo di tecniche di biologia molecolare, come la Real Time PCR, sono stati introdotti test che permettono una identificazione rapida e precisa del patogeno. . La metodica utilizzata è basata sulla tecnica PCR Reverse Dot Blot che garantisce massima affidabilità e tempi di risposta rapidissimi.

Materiale analizzato

DNA estratto da tamponi cervico-vaginali, uretrali, rettali, urina, liquido seminale.

HIV-1

Aspetti generali

Il virus dell’Immunodeficienza Umana (HIV, Human Immunodeficiency Virus) è l’agente responsabile

Senza nome

della Sindrome da Immuno Deficienza Acquisita (AIDS, Acquired Immuno Deficiency Syndrome). L’HIV è suddiviso in due ceppi: HIV-1 localizzato prevalentemente in Europa, America , Asia e Africa centrale e HIV-2 confinato in Africa occidentale che determina una sindrome clinicamente più moderata rispetto al ceppo 1. L’HIV è un retrovirus (virus a RNA) appartenente ai lentivirus che sono caratterizzati dall’avere un tempo di incubazione molto lungo. Il genoma di HIV-1 presenta un’ampia variabilità genetica che ha portato a classificarlo in tre gruppi: il gruppo M (Major) che a sua volta e suddiviso in 12 sottotipi (A,B,C,D,F,G,H,J,K,AB,AE,AG), gruppo N e gruppo O. Il virus si trasmette per via sessuale (secrezioni vaginali, sperma, sangue), ematica mediante contatto con sangue e/o emoderivati infetti, verticale da madre a figlio durante la gravidanza, parto o allattamento. Dopo l’infezione il virus entrato nel circolo sanguigno, va alla ricerca di particolari cellule in cui replicarsi; in particolare attacca i linfociti T CD4+, cellule del sistema immunitario (Fig.1). Una volta all’interno l’RNA virale viene convertito in DNA che si integra nel genoma della cellula ospite (provirus). A questo punto l’HIV può restare inattivo all’interno della cellule o iniziare il processo replicativo che porta alla formazione di nuove particelle virali che vengono espulse dalla cellula, provocandone la distruzione, e liberate nel circolo sanguigno, pronte ad infettare nuove cellule T CD4+. L’infezione acuta della durata di 1-2 settimane generalmente ha un quadro clinico poco specifico, simil-influenzale. Al termine della fase acuta i sintomi scompaiono e inizia la lenta risposta immunitaria da parte dell’organismo, che può durare 2-8 settimane, con la produzione di anticorpi (sieropositività). In assenza di terapia, la fase di latenza (o cronica) può durare per molti anni e sebbene le condizioni cliniche del paziente sieropositivo siano stabili, il sistema linfatico subisce un progressivo deterioramento, poiché la replicazione virale persiste e i linfociti T CD4+ distrutti non vengono adeguatamente rimpiazzati. Quando il loro numero scende al di sotto della soglia critica (200/ml) l’organismo non è più in grado difendersi da “infezioni opportunistiche”, causate da microorganismi (batteri, funghi, virus, protozoi) normalmente scarsamente patogeni che, in condizione di bassissimi livelli di linfociti T CD4+, possono provacare patologie polmonari, gastro-intestinali, oculari e cerebrali con gravi manifestazioni cliniche (AIDS conclamato). Attualmente il trattamento terapeutico è a base di farmaci anti-retrovirali che non permettono di eliminare il virus ma ne limitano la proliferazione, contenendo la distruzione di cellule T CD4+.

Test molecolare

E’ disponibile un test molecolare (HIV-1 Viral Load) per la valutazione della carica virale, espressa in copie/ml, presente nel plasma. Il test sensibile e accurato permette di rilevare la presenza di RNA virale, di tutti i sottotipi di HIV-1, fino a 20 copie/ml e la quantificazione in un ampio range di linearità (40-10.000.000 copie/ml). Il test molecolare HIV-1 è indicato principalmente per il controllo di donatori di gameti maschili e femminili, cellule staminali, ma anche per l’anticipo di “copertura” del periodo finestra dopo esposizioni accertate al virus o per monitorare l’efficacia di farmaci antivirali.

Tempi di risposta

Il risultato del test è disponibile dopo circa 3 ore dal prelievo.


HPV-DNA Test

 

Aspetti generali

Il cancro del collo dell’utero o cervicale (cervice uterina) è attualmente riconosciuto come il primo tumore solido di origine virale identificato nelle donne. Nella popolazione mondiale il DNA del virus HPV (Human Papilloma Virus) è presente praticamente in tutti i carcinomi del collo dell’utero e nelle lesioni che lo precedono (99,7% dei casi). L’HPV è un virus molto comune che si trasmette per via sessuale e normalmente non da alcun disturbo poiché come avviene per altri virus (raffreddore, influenza) viene eliminato dal sistema immunitario. Nella popolazione vi sono però individui in cui l’infezione è persistente, cioè non riescono a liberarsi del virus che diventa causa di lesioni, le quali progredendo possono dare origine al cancro del collo dell’utero.

Aspetti genetici

I virus HPV non sono tutti uguali fra loro; ad oggi sono stati individuati più di 100 diversi tipi che sono stati classificati come a “basso rischio” e ad “alto rischio” di insorgenza di cancro del collo dell’utero. Ciascun genotipo virale è identificato dalla sigla HPV seguita da un numero (ad es. HPV 42, HPV 33, ecc.). I genotipi HPV 16 e HPV 18 sono responsabili di oltre il 70% dei casi di tumore del collo dell’utero, per cui sono considerati ad “alto rischio” oncogeno.

Test genetico

Il test HPV-DNA utilizzato  permette di evidenziare la presenza del DNA dei 14 tipi di virus HPV alto rischio e di definire il genotipo per HPV 16 e HPV 18/45. In tabella 1 sono riportati i genotipi HPV ricercati.

Genotipo HPV alto rischio 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68

Tabella 1- Genotipi HPV ricercati
Un individuo può essere portatore di due o più genotipi diversi di HPV (coinfezione).
Tecnicamente il test prevede l’amplificazione mediante PCR Real Time della regione E6/E7 del genoma virale e rilevazione mediante tecnica Reverse Dot Blot.

Tempi di risposta

Il risultato del test è disponibile dopo circa  3-5 giorni dal prelievo.

Materiale analizzato

DNA estratto da cellule della cervice uterina e della mucosa oro-faringea prelevati con tampone a secco o con mezzi per citologia in fase liquida (thinprep, ecc.). Il test può essere eseguito anche su DNA di soggetti di sesso maschile estratto da tampone uretrale o balano-prepuziale o da spermatozoi (liquido seminale

HCV

 

Aspetti generali

Il virus dell’epatite C (HCV, Hepatitis C Virus) è un virus ad RNA a singolo filamento appartenente alla famiglia dei Flaviviridae ed è l’agente responsabile dell’Epatite virale C, una malattia che colpisce il fegato. Nel mondo sviluppato, la via di trasmissione principale del virus è legata all’uso di droghe per via endovenosa, mentre nei paesi in via di sviluppo le cause maggiori sono le trasfusioni di sangue e trapianti d’organo non sicuri ovvero non preventivamente controllati per la presenza del virus. Il virus può essere trasmesso per via sessuale, anche se con una frequenza molto inferiore rispetto all’HIV e/o al virus dell’epatite B (HBV). Tatuaggi e piercing se eseguiti in strutture non autorizzate sono associati ad un aumentato rischio di contrarre l’infezione. Nel 15-20% dei casi l’infezione da virus dell’epatite C si risolve spontaneamente; nell’80% dei casi si sviluppa un’infezione cronica che può portare, dopo molti anni (circa 20-30 in assenza di altre concause), a cirrosi epatica, con compromissione anatomo-funzionale del fegato, e cancro al fegato. Si stima che circa 185 milioni di persone, il 3% della popolazione mondiale, hanno un’infezione da HCV.

 

Test molecolare

E’ un test molecolare (HCV Viral Load) per la valutazione della carica virale, espressa in IU/ml, presente nel siero o plasma. Il test sensibile (6.1 IU/ml su siero, 4 IU/ml su plasma) e accurato permette di rilevare e quantificare la presenza di RNA virale in un ampio range di linearità (10-100.000.000 IU/ml). Il test molecolare HCV Viral Load può essere utilizzato sia per la diagnosi (per confermare l’infezione il test può essere eseguito 1-2 mesi dopo l’esposizione al fattore di rischio) che per il monitoraggio dell’HCV nei pazienti in trattamento farmacologico.

 

Tempi di risposta

Il risultato del test è disponibile dopo circa 15 giorni  dal prelievo.